Startseite Fischgesundheit Projektbericht Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV-I) am Beispiel von Proben aus sächsischen Angelgewässern

Karpfenteich1_kleinProjektbericht - Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV-I) am Beispiel von Proben aus sächsischen Angelgewässern

- gefördert aus Mitteln der Fischereiabgabe des Freistaates Sachsen -

Dr. Kerstin Böttcher, Dr. Grit Bräuer, Sächsische Tierseuchenkasse

  Einleitung

Im Jahr 2003 wurde die Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV-I) erstmalig bei Nutzkarpfen in Sachsen nachgewiesen. Betroffen waren drei Fischhaltungsbetriebe. Die fünf infizierten Karpfenbestände zeigten hochgradige Verlustgeschehen.

Bis heute hat die Zahl der nachgewiesenen Infektionen und der betroffenen Betriebe dramatisch zugenommen. So wurde im Jahr 2008 die KHV-I in 109 Karpfenbeständen aus 26 Betrieben festgestellt, so dass von einer weiten Verbreitung des Virus in den Fischhaltungsbetrieben ausgegangen werden muss. Demgegenüber wurde das Virus in Angelgewässern im Zusammenhang mit Fischsterben bisher nur selten nachgewiesen.

Nach wie vor ist jedoch die epidemiologische Bedeutung verschiedener Angelgewässer im Zusammenhang mit KHV-I-Ausbrüchen in darunterliegenden Teichwirtschaften ungeklärt.

Erstmalig im Jahr 2008 erfolgten KHV-Nachweise auch in zwei Wildgewässern, die von den sächsischen Anglerverbänden als Angelgewässer benutzt werden.

Klare epidemiologische Hintergründe waren jedoch nicht ermittelbar. Es bestand lediglich der Verdacht auf die Einschleppung mit zugekauften Karpfen.

Als Haupteinschleppungsursache in bislang unbelastete Gewässer gilt der Besatz mit unerkannten Virusträgern. In der Vergangenheit musste dies trotz vorhergehender negativer Untersuchungen von klinisch gesunden Satzfischen auf KHV mittels Erreger- bzw. Erregererbgutnachweis durch die in Sachsen angewandte PCR Technik mehrfach festgestellt werden.

In unerkannten Virusträgern ist die Zahl der vorhandenen Viren derart gering und zudem unregelmäßig verteilt, dass ein Nachweis schwierig sein kann. KHV gehört zu den Viren, die sich im Wirtsorganismus latent aufhalten. Das heißt, im Verlaufe der Infektion wird ein Zustand erreicht, in dem kein infektiöses Virus mehr nachweisbar ist, es sich aber in Wirtszellen zurückgezogen hat und durch den Einfluss von Stressfaktoren wieder reaktiviert werden kann.

Deshalb sind zusätzliche Methoden erforderlich, um die Nachweissicherheit zu erhöhen. In der Diskussion stehen immer wieder serologische Methoden, die dazu dienen, bestimmte Abwehrstoffe (spezifische Antikörper) des Fisches zu ermitteln. Diese Stoffe werden als Reaktion des Fischkörpers auf den Kontakt mit einem Krankheitserreger – in diesem Fall KHV – gebildet. Antiörper sind noch nachweisbar, wenn der Erreger nicht mehr im Körper zirkuliert bzw. sich inbestimmte Organe zurückgezogen hat. Ob sie diagnostisch verwertbar sind und wie lange sie meßbar sind, ist noch umstritten. Deshalb sollten im Rahmen des Projektes zwei Methoden zum KHV-Antikörpernachweis geprüft und mit der vorhandenen, validierten Methode zum Erregernachweis verglichen werden.

Durch den Vergleich der Laborbefunde, die mit den verschiedenen Methoden erhoben wurden, sollten Hinweise zur Verwertbarkeit dieser Methoden in der Praxis ermittelt werden. Die Ergebnisse der Antikörpernachweise sollten an den Erregernachweisen bzw. den klinischen Ergebnissen auf Plausibilität geprüft werden.

Zusätzlich sollte der KHV-I-Status von vier geografisch nicht im Zusammenhang stehenden sächsischen Angelgewässern durch diese Untersuchungen ermittelt werden. In einem Gewässer gelang es jedoch nicht, Karpfen zur Beprobung zu fangen. Um das Probenkontingent auszuschöpfen, wurden Proben aus infizierten Fischbeständen (Positivkontrollen) sowie aus unverdächtigen Fischhaltungsbetrieben (“Negativkontrollen”) gewonnen.


Material und Methoden

 

Zum Vergleich der drei diagnostischen Methoden wurden Paralellproben von einzelnen Fischen untersucht. Je Fisch wurden zum einen Gewebeproben mittels molekularbiologischer Methode auf KHV-Erbgut, zum anderen Blutserumproben durch zwei verschiedene Methoden auf das Vorhandensein von KHV-spezifischen Antikörpern untersucht.

 

Herkunft der Proben

 

Die Proben wurden im Zeitraum 28.5.2009 bis 23.8.2010 von zweisömmrigen (K2), dreisömmrigen (K3) oder älteren (KL) Karpfen entnommen.

Die beprobten Karpfen stammten aus folgenden Gewässern und Betrieben:

Am Beispiel von Proben aus dem Haselbacher See sollte untersucht werden, wie sich die KHV-Infektion nach den klinischen Ausbrüchen des Jahres 2008 weiterentwickelt.

Weiterhin wurden Proben aus den Talsperren Bautzen und Quitzdorf gewonnen. Diese waren zwar bisher klinisch unauffällig und anhand geringer Probenzahlen negativ auf KHV untersucht worden, jedoch lagen bis dahin keine statistisch aussagekräftigen Laborbefunde für diese Gewässer vor.

Die geplanten Proben aus der Lunzenau im Einzugsgebiet der Zwickauer Mulde mussten entfallen, da hier keine Karpfen zur Probenahme gefangen werden konnten.

Die Karpfen aus den Angelgewässern wurden durch Angler gefangen und für die Beprobung zur Verfügung gestellt.

Um in den Methodenvergleich vorberichtlich abgesicherte Proben einzubeziehen, wurden zusätzlich unverdächtige und infizierte Fischbestände als Negativ- und Positivkontrollen beprobt.

Die Teichwirtschaften Müglenz (Kategorie II) und Cunnersdorf (Kategorie III) sowie die Fischzucht Wolf (Kategorie II) werden seit Jahren gemäß KHV-Programm regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV untersucht. Hier wurden jeweils Proben gezogen und als “Negativkontrollen” verwendet.

Als Positivkontrollen wurden zwei Fischbestände der Teichwirtschaft Weißig beprobt, die 2009 bzw. 2010 einen akuten KHV-I-Ausbruch erlitten hatten (Kategorie V) sowie ein Fischbestand der Kreba Fisch GmbH, der 2009 zu einem KHV-positiven Restbestand (akuter KHV-Ausbruch 2008) hinzugesetzt wurde, jedoch keine KHV-typische Klinik ausbildete.

 

Probengewinnung

 

Die Blutentnahme erfolgte aus der kaudalen Hohlvene mittels Serum-Kabevette (R) mit aufgesetzter, steriler Kanüle (0,90 x 40 mm). Durch Zentrifugation wurde das Serum von den festen Blutbestandteilen getrennt, abpipettiert und in je drei Teilproben in Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt.

Für die molekularbiologische Untersuchung auf Erregererbgut wurden mit sterilen Instrumenten Gewebeproben der Karpfen entnommen. Da in den Angelgewässern zumeist ältere wertvolle Fische gefangen wurden, wurde einer Sektion der Karpfen durch die Angler nicht zugestimmt, so dass sich die Probenahme hier auf Kiemenbioptate beschränkte. An den anderen Probenahmestellen erfolgte die Sektion der Fische mit Entnahme von Rumpfnierengewebe. Das Gewebe wurde entweder für den sofortigen Versand in Transportmedium für virologische Proben überführt oder im Fall einer erforderlichen Konservierung in Kunststoffröhrchen ohne Medium verbracht.

Das Untersuchungsmaterial (Gewebe und drei Serumproben je Fisch) wurde so beschriftet, dass es eindeutig einer bestimmten Herkunft sowie jeweils einem Karpfen zugeordnet werden konnte.

Notiert wurde zu jedem Fisch Entnahmedatum, Wassertemperatur, Altersklasse, Herkunft und Vorbericht.

Probenkonservierung und –versendung

 

Die Serumproben wurden unmittelbar nach Zentrifugation und Abfüllung bei -20°C eingefroren. Nach Ende des Beprobungszeitraumes wurden alle vorgesehenen Proben gemeinsam zur jeweiligen Untersuchungseinrichtung geschickt. Dazu wurden isolierende Styroporkisten verwendet und mit Kühlakkus bestückt.

Es wurden Dienstleister beauftragt, die eine Auslieferung der Proben beim untersuchenden Labor innerhalb von 24 Stunden zusichern konnten.

Die Gewebeproben wurden in Transportmedium für virologische Proben der Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- undf Veterinärwesen Sachsen (LUA) gekühlt und nach Möglichkeit unmittelbar nach der Gewinnung per Kurier zur Untersuchungsstelle geliefert, so dass sie 24 – 48 Stunden nach Entnahme dort eintrafen. In einigen Fällen war bis zur Versendung mittels Kurier eine Konservierung ohne Transportmedium bei -20°C erforderlich.

Untersuchungsverfahren

 

Alle Proben wurden einzeln untersucht mit folgenden Methoden:

1.) Die Untersuchung auf Vorhandensein von Erbgut des Erregers wurde mittels eines molekularbiologischen Verfahrens, der „Polymerase Chain Reaction“ (PCR, Polymerase-Kettenreaktion) an der LUA, Standort Dresden durchgeführt. Hierbei werden bekannte Teile des Erreger-Erbgutes im Labor vervielfältigt. Die so entstandenen PCR-Produkte werden mittels fluoreszierender Farbstoffe in Agarosegel dargestellt oder die Fluoreszenz wird während der PCR direkt gemessen.

Folgende Arbeitsanleitungen kamen zur Anwendung:

PCR nach Gilad 2002 in Verbindung mit nested PCR nach Bergmann et al. 2006 und Realtime PCR nach Gilad et al. 2004.

Untersuchungsmaterial: Kiemengewebe oder Kiemen- und Rumpfnierengewebe

2.) Serumneutralisationstest (SNT) am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Insel Riems:

Dazu wird das zu untersuchende Serum in verschiedenen Verdünnungsstufen mit dem KHV gemischt, für mindestens eine Stunde inkubiert und anschließend auf eine Zellkultur gegeben. Diese wird für mindestens sieben Tage bei 26°C inkubiert. Sind neutralisierende Antikörper im Serum vorhanden, wird das Wachstum des KHV je nach Verdünnungsstufe des Serums gehemmt. Keine Wachstumshemmung des KHV tritt auf, wenn keine Antikörper gegen das Virus im Serum vorhanden sind, die Zellen der Zellkultur werden zerstört.

Untersuchungsmaterial: Serum

3.) Antibody Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (Antikörper-ELISA) am Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science (Cefas) Weymouth Laboratory, UK:

Hierbei wird gereinigtes KHV in die 96 Vertiefungen einer Mikrotestplatte (ELISA-Platte) gegeben und mit Magermilchpulver geblockt. Das zu testende Serum sowie negative und positive Kontrollseren werden in Doppelansätzen für eine Stunde auf den Platten inkubiert.

Die an das KHV-Antigen gebundenen spezifischen Karpfenantikörper aus dem Proben-Serum werden mit monoklonalen Anti-Karpfen-IgM-Antikörpern von der Maus in einer 45-minütigen Inkubation detektiert. Die so gebundenen monoklonalen Antikörper werden nach einer 45-minütigen Inkubation mit polyklonalen Anti-Maus-IgM-Antikörpern von der Ziege, die mit Peroxidase konjugiert sind, nachgewiesen. Mittels der gebundenen Peroxidase wird enzymatisch Tetramethylbenzidin (TMB) in einer Farbreaktion umgesetzt.

Nach Stoppen der Farbreaktion mit Schwefelsäure wird die Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 450 nm gemessen.

Untersuchungsmaterial: Serum

 

Auswertung

 

Die Zusammenfassung der Ergebnisse sowie die Auswertung erfolgte durch den Fischgesundheitsdienst der Sächsischen Tierseuchenkasse in enger Zusammenarbeit mit dem Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems (FLI).

Die Ergebnisse werden in geeigneter Form veröffentlicht.

 

Ergebnisse

 

Insgesamt wurden 85 Karpfen beprobt.

Es wurden 77 Gewebeproben mittels PCR auf KHV-Genom untersucht. Acht Gewebeproben waren nicht verwertbar.

80 Serumproben wurden im Cefas per ELISA und 83 Serumproben am FLI per SNT auf KHV-spezifische Antikörper untersucht. Die übrigen Serumproben waren nicht verwertbar oder es konnte Probenmaterial nicht in ausreichender Menge gewonnen werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

 

Tabelle 1: Ergebnisse verschiedener Untersuchungsmethoden auf KHV

Methode

n

negativ

verdächtig

positiv

PCR (Genomnachweis)

77

73

---

4

ELISA Cefas (AK-Nachweis)

80

35

13

32

SNT FLI (AK-Nachweis)

83

28

16

3

78 Serumproben wurden sowohl mittels ELISA (Cefas) als auch SNT (FLI) untersucht. In 41 Fällen (ca. 53 %) stimmten die Ergebnisse überein, in 37 Fällen (ca. 47 %) erbrachten die verschiedenen Methoden unterschiedliche Ergebnisse. Dabei kamen alle denkbaren Ergebniskombinationen vor. Besonders herauszustellen sind die vollkommen gegensätzlichen Ergebnisse bei neun Proben ELISA negativ/ SNT positiv und bei sieben Proben ELISA positiv/ SNT negativ. Dies entspricht über 20 %. Die Einzelheiten sind in Tabelle 2 sowie Abbildung 1 und 2 aufgeführt.

 

Abbildung 1: Vergleich der Meßwerte im ELISA (SP-ratio) und SNT (Titer)

ELISA: < 6,05 = negativ, 6,05 bis < 14,0 = verdächtig, ≥ 14,0 = positiv (rote Linie)

SNT: < 1:4 = negativ, 1:4 bis 1:6 = verdächtig, ≥ 1:8 = positiv (rote Linie)

Proben-Nr. 1 – 42 = “Negativkontrollen”

Proben-Nr. 43 – 52 = Positivkontrollen

Proben-Nr. 53 – 85 = Angelgewässer

Tabelle 2: Ergebniskombinationen bei verschiedenen Untersuchungsmethoden auf KHV-spezifische Antikörper

Anzahl der Proben mit Ergebniskombination...

ELISA (Cefas)

SNT (FLI)

16

negativ

negativ

4

verdächtig

verdächtig

21

positiv

positiv

9

negativ

verdächtig

9

negativ

positiv

7

positiv

negativ

5

verdächtig

negativ

4

verdächtig

positiv

3

positiv

verdächtig

Abbildung 2: Darstellung der prozentualen Verteilung der Ergebniskombinationen bei zwei Untersuchungsmethoden (ELISA, SNT) auf KHV-spezifische Antikörper

Sieben Proben wurden mehrfach im SNT untersucht. Die Untersuchung derselben Proben zu verschiedenen Zeitpunkten brachte teilweise unterschiedliche, zum gleichen Zeitpunkt annähernd identische Ergebnisse (Tabelle 3).

 

Tabelle 3: Untersuchung von sieben Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten im SNT

Proben-nr.

2.12.09

1. Teilprobe

30.6.10

1. Teilprobe

23.10.10

2. Teilprobe

5.11.10

2. Teilprobe

5.11.10

1. Teilprobe

1

---

negativ

positiv

verdächtig

verdächtig

2

---

negativ

positiv

negativ

negativ

3

---

verdächtig

positiv

negativ

negativ

4

---

negativ

positiv

negativ

verdächtig

5

---

negativ

positiv

positiv

positiv

6

negativ

---

positiv

positiv

positiv

7

negativ

---

positiv

positiv

positiv

 

Im Serum der vier Karpfen, in deren Gewebe KHV-Genom mittels PCR nachgewiesen wurde, konnte ein Antikörpertiter im SNT bei allen und im ELISA bei drei Tieren ermittelt werden. Beim vierten untersuchten Serum brachte der ELISA ein verdächtiges Ergebnis.

Die übrigen 73 Karpfen mit negativem PCR-Befund zum Zeitpunkt der Probenentnahme wiesen unterschiedlichste Befunde bei den Untersuchungen auf KHV-spezifische Antikörper auf. Die Verteilung entspricht nahezu der Gesamtverteilung der Ergebnisse (Tabelle 2, Abbildung 2).

 

Als “Negativkontrollen” wurden 31 Karpfen aus drei KHV-unverdächtigen west- und mittelsächsischen Betrieben beprobt:

1.) In der Teichwirtschaft Cunnersdorf wurden 2005 und 2006 einzelne KHV-Nachweise bei Kv bzw. K1 erhoben. Danach wurde der Betrieb regelmäßig und immer mit negativem Ergebnis auf KHV-Genom untersucht (Kategorie III). Zu keinem Zeitpunkt war eine KHV-typische Klinik festgestellt worden. Der Betrieb kauft jährlich Karpfenbrut aus Bayern zu. Es wurden neun Karpfen (K2) untersucht.

2.) Die Fischzucht Wolf verfügt über eigene Laichfischbestände und wird seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV-Genom untersucht (Kategorie II).

Zur Beprobung kamen zwölf Karpfen (K3).

3.) Die Teichwirtschaft Müglenz besitzt ebenfalls eigene Laichkarpfen und kauft keine Satzfische zu. Der Betrieb liegt isoliert und wird seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV-Genom untersucht (Kategorie II). Hier wurden zehn Karpfen(K3) untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4: Untersuchungsergebnisse bei den “Negativkontrollen”

Betrieb

Vorbericht

n

ELISA

SNT

PCR

1

regelm. Brutzukauf aus BY, 2005+06 einzelne KHV-                                           Nachweise, danach immer negativ, bisher niemals KHV-Klinik (KAT. III)

9

9x neg

6x neg

1x verd

1x pos

neg

2

eigene Laichfischbestände,

seit 2003 regelmäßige                                           Untersuchung m. negativen                                       Ergebnissen auf KHV (KAT. II)

12

6x neg

2x verd

4x pos

11x neg

1x verd

neg

3

eigene Laichfische, kein Zukauf von Satzfischen, seit 2003 regelmäßig mit                                                 negativen Ergebnissen                                                               auf KHV untersucht (KAT. II)

10

6x neg

4x verd

2x neg

4x verd

4x pos

neg

Zwecks Positivkontrolle wurden zwölf Karpfen aus bekanntermaßen KHV-positiven Beständen untersucht.

4.) Im Schwarzen See (a) der Teichwirtschaft Weißig wurde 2009 ein massiver KHV-Ausbruch festgestellt, im Bunteteich (b) war 2010 ein klinischer KHV-Ausbruch zu verzeichnen. Beprobt wurden in beiden Teichen K3.

5.) Der Neuteich Diehsa der Kreba Fisch GmbH war im Jahr 2008 von einer klinischen KHV-I betroffen. Dieser Teich konnte aufgrund seiner geografischen Bedingungen nicht komplett abgefischt, trockengelegt und gekalkt werden. Nach Abfischung eines Großteils der Karpfen wurde er wieder bespannt und mit KHV-negativen Karpfen neu besetzt.

Tabelle 5 zeigt die zusammengefassten Untersuchungsergebnisse.

Tabelle 5: Untersuchungsergebnisse bei den Positivkontrollen

Betrieb

Vorbericht

n

ELISA

SNT

PCR

4a

Teich 1, massiver KHV-Ausbruch 2009 (KAT. V)

8

1x neg

1x verd

6x pos

1x neg

 

7x pos

n.a.

4b

Teich 2, massiver KHV-Ausbruch 2010 (KAT. V)

2

1x verd

1x pos

 

2x pos

2x pos

5

2008 akuter KHV-I-Ausbruch, keine komplette Abfischung, Trockenlegung + Kalkung durchgeführt, Neubesatz mit KHV-negativen Fischen (KAT. V)

2

1x neg

1x pos

 

2x pos

2x neg

n.a. = nicht auswertbar

Aus den Angelgewässern Haselbacher See, Talsperre Bautzen und Talsperre Quitzdorf konnten insgesamt 35 Karpfen beprobt werden.

Bei Karpfen aus dem Haselbacher See wurde im Jahr 2008 mittels PCR KHV-Genom in Verbindung mit einem Verlustgeschehen nachgewiesen. Danach sind keine Symptome oder Todesfälle bei Karpfen mehr bekannt geworden.

Bei den Talsperren Bautzen und Quitzdorf handelt es sich um bislang KHV-unverdächtige Gewässer, in denen bis heute kein Karpfensterben nachgewiesen wurde. Es gelangte bisher jedoch nur eine geringe Probenanzahl aus diesen Gewässern zur PCR-Untersuchung, die mit negativen Ergebnissen auf KHV abgeschlossen wurde.

Die im Rahmen dieses Projektes erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

 

Tab. 6: Untersuchungsergebnisse der Proben aus den Angelgewässern

Gewässer

n

ELISA

SNT

PCR

Haselbacher See

5

2x neg

2x verd

1x pos

1x neg

2x verd

2x pos

5x neg

Talsperre Bautzen

17

7x neg

2x verd

8x pos

7x neg

7x verd

3x pos

17x neg

Talsperre Quitzdorf

13

2x neg

1x verd

10x pos

 

 

13x pos

11x neg

 

2x pos

 

Diskussion

Die Untersuchungsergebnisse der beiden verwendeten serologischen Methoden ELISA (Cefas) und SNT (FLI) zum Nachweis KHV-spezifischer Antikörper im Serum von Karpfen wiesen eine relativ geringe Übereinstimmungsrate auf (ca. 53%). Bei den nicht übereinstimmenden Ergebnissen kamen alle denkbaren Kombinationen vor. In über 20% der Fälle wurden sogar völlig entgegengesetzte Befunde (positiv – negativ oder negativ – positiv) erhoben.

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass keine der beiden Methoden als Methode der Wahl angesehen werden kann. Die unterschiedlichen Befunde könnten dadurch erklärt werden, dass unterschiedliche Arten von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden: Beim ELISA werden alle Antikörper, die sich an einen präparierten Antigenausschnitt binden, dargestellt, beim SNT nur die Antikörper, die in der Lage sind, das Virus zu neutralisieren.

Bezogen auf das Einzeltier wurde festgestellt, dass bei 100 % der KHV-PCR-positiven Karpfen und bei etwa 44 % der KHV-PCR-negativen Karpfen mit einer oder beiden serologischen Methoden KHV-spezifische Antikörper nachweisbar waren.

Die Ergebnisse auf den Bestand bezogen waren ähnlich: In Beständen, die bekanntermaßen eine KHV-Klinik durchgemacht hatten (Positivkontrollen), wurden bis zu 100 % der Proben mit den eingesetzten serologischen Methoden positiv auf KHV-spezifische Antikörper getestet. Antikörper waren jedoch auch in Beständen unabhängig vom Seuchenstatus (“Negativkontrollen”) in 0 bis 40 % der Proben nachweisbar.

In den untersuchten Angelgewässern verhielt es sich entsprechend. In 20 – 50 % der Proben aus den beiden Gewässern ohne aktuellem KHV-Genom-Nachweis (PCR) wurden mittels serologischer Methoden KHV-spezifische Antikörper festgestellt. In dem Gewässer mit zeitgleichem KHV-Genom-Nachweis (PCR) wurden bis zu 100 % der untersuchten Seren positiv auf KHV-Antikörper getestet.

Ein Nachweis von Antikörpern bei gleichzeitigem negativen Ergebnis im direkten Erregernachweis ist dabei nicht als Widerspruch zu sehen. Sind viele spezifische Antikörper vorhanden, so können sie das KHV derart unterdrücken, dass es sich in bestimmte Zellen zurückzieht, nur in geringer Virusmenge vorliegt und somit kaum nachweisbar ist (mündl. Mitteilung FLI).

Im Rahmen dieser Untersuchung erfolgten mehr KHV-Antikörpernachweise als erwartet, insbesondere bei den “Negativkontrollen”. Dabei trat vermutlich ein bestimmter Anteil falsch positiver Ergebnisse in Erscheinung.

Eine denkbare Möglichkeit für falsch positive Ergebnisse wäre der Nachweis von kreuzreagierenden Antikörpern, die beispielsweise gegen andere Herpesviren wie Karpfenpocken gebildet wurden.

Möglicherweise kursiert auch eine andere, apathogene KHV-Variante, die eine entsprechende Antikörperbildung induziert, jedoch keine Krankheitserscheinungen verursacht und auch mit der herkömmlichen PCR nicht nachweisbar ist.

Eine weitere mögliche Ursache könnten unspezifische, “natürliche” Antikörper sein, die mit steigendem Alter der Fische in zunehmendem Maße gebildet werden, in den Tests reagieren und zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten (mündl. Mitteilung Prof. Steinhagen). Der einzige, im ELISA komplett negativ getestete Bestand war gleichzeitig der jüngste untersuchte Bestand (K2), was diese Theorie untermauert.

Insgesamt deuten die Befunde, die im Rahmen dieses Projektes erhoben wurden, darauf hin, dass sowohl die Ergebnisse des ELISA als auch die des SNT mit Einschränkungen zu interpretieren sind. Dies wird auch noch einmal deutlich bei der Mehrfachuntersuchung von Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten, die teilweise verschiedene oder widersprüchliche Ergebnisse lieferte. Die Untersuchung von Teilproben im SNT zu ein und demselben Zeitpunkt dagegen erbrachte nahezu identische Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass Ergebnisse maßgeblich von den verwendeten Labormaterialien bzw. deren Chargen oder von der Art und Weise der Test-Durchführung abhängig sind. Ähnliche Feststellungen können für Mehrfachuntersuchungen im ELISA (anderes Projekt, noch nicht veröffentlicht) getroffen werden.

Keine der beiden hier angewendeten serologischen Methoden (ELISA, SNT) alleine lässt eine sichere Aussage über den Seuchenstatus einer Population zu. Empfehlenswert sind die serologischen Methoden allenfalls als Ergänzung zum direkten Erregernachweis (PCR), wodurch die Aussagekraft möglicherweise erhöht werden kann.

Aufgrund der Biologie des KHV ist davon auszugehen, dass jeder Karpfen mit Antikörpernachweis auch Virusträger ist. Es müsste sich also bei einem serologisch positiven Individuum bzw. Bestand nach den neuesten Vorgaben des FLI (24 h bis 5 Tage nach Streßeinwirkung) auch Virusgenom mittels PCR nachweisen lassen.

Weitere Forschung auf diesem Gebiet ist unbedingt erforderlich, um die diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis der KHV-I zu verbessern.